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探針設(shè)計(jì)的原則具體體現(xiàn)如下：
1. 先選擇好探針，然后設(shè)計(jì)引物使其盡可能的靠近探針。
2. 所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段——這是因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響反應(yīng)效率，而且還會(huì)阻礙酶的擴(kuò)增。建議先進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)，如果不能避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。
3. 擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)不超過(guò)400bp，理想的擴(kuò)增長(zhǎng)度在100-150bp內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性。
4. 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號(hào)。
5. 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G） 。
6. 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。
在原理上與引物設(shè)計(jì)是比較類似的。只是因?yàn)樘结樞蛄幸笃ヅ涠群芨?，所以?duì)于探針的GC含量和Tm值都是有嚴(yán)格要求的，而且還要考慮到與上下游引物相匹配。假如你手頭已經(jīng)有了染料法的引物，然后想仍然使用這一對(duì)引物、在這一對(duì)引物對(duì)應(yīng)的序列中間選一段作為探針可以嗎？我們不建議這么做。因?yàn)槟銌为?dú)設(shè)計(jì)的上下游引物沒(méi)問(wèn)題，單獨(dú)設(shè)計(jì)的探針看起來(lái)也沒(méi)問(wèn)題，但把引物與探針?lè)旁谝黄?，就有可能出現(xiàn)參數(shù)不兼容的問(wèn)題。所以還是三者放在一起設(shè)計(jì)才好。
